限于篇幅，本文只探讨3个议题，对其它相关问题感兴趣的读者请阅文末的参考文献。
将ELISA方法转移到其它分析平台
在开发临床前LBA分析方法时，ELISA可能是首选的方法，因其简单性，低成本，并且不需要专门的仪器设备。但是，如果ELISA方法不能满足灵敏度和稳健性要求时，特别是对GLP毒理/毒代研究而言，需要在一个CRO实施该研究时，往往需要将一个ELISA方法转移到MSD或者GYROS平台至上实施。
MSD
从ELISA转移到MSD平台相对简单；当使用特定抗体对的ELISA方法无法到达所需要的灵敏度时，会经常实施这样的转移来减少基质效应，提高灵敏度或增加定量动态范围。然而，就像其它方法转移一样，试剂的差异和不同的修饰（modifications），如ruthenium或生物素标记，可能会影响方法的效能。因此，虽然可以在MSD上重新使用已有的抗体对和测试格式，但将需要调整校准品（Cs）和QCs的浓度，并充分验证新的方法。
Gyrolab
在理想的情况下，需要小体积样本或半自动化的分析方法应当直接在Gyrolab平台上开发。如果一对抗体（antibody pair）可用于相同的捕获-检测组合，则将ELISA方法直接成功地转移到Gyrolab上的可能性更大； 尽管可能需要重新优化，以提高灵敏度和/或扩展动态范围。 重新优化包括测试抗体对的组合；调整抗体浓度，以最大化灵敏度和动态范围；测试选择性，以尽量减少MRD；以及重建动态范围和QC水平。在转移方法到Gyrolab平台的时候，修改试剂，如使用生物素（biotin）或荧光标记，也会影响测定性能。在任何情况下，都需要在此平台实施完全的方法验证。
BIAcore
BIAcore和ELISA之间的差异太大，不能直接转移分析方法；因此，需要进行方法的再开发，和全面的方法验证。 由于BIAcore是一个基于流体的系统，因此不宜直接与基于固相（例如，微孔板）的免疫测试方法进行比较。需要进一步开发BIAcore方法，例如芯片的固定（immobilization）和再生条件，用于固定和再生缓冲液的试剂，试剂的稳定性，确定标准品和质量控制样品，以及配体结合测试（LBA）方法的其他方面。
Luminex
如果以Luminex格式定量单个待测物，则从ELISA格式的方法转移在测试方法的布局方面非常简单，尽管需要制备，评估和验证新的试剂（例如，dye-coated beads，荧光标记的检测抗体）。有时，在洗涤步骤中需要额外的微孔板（真空或磁珠板）。如果需要将多个ELISA方法组合并转移到一个Luminex方法（由于其multiplexing功能），则需要进行额外的研究；并且，优化方法参数可能需要更多的方法开发时间。总体而言，必须全面验证单通路和multiplex格式的Luminex方法；ELISA方法中使用的条件有助于确定开发Luminex方法的格式和抗体对。
分析大数量样本和仪器故障
MSD
对于在MSD上的样本分析，校准品（Cs）和QCs的位置通常与ELISA的位置相同。另一方面，值得注意的是：对微孔板一次只读取四个孔的数据，而且在施加电压后只能读取一次。因此，如果发生仪器故障，可能无法测定整个校准曲线；或者取决于微孔板设置（plate set-up），可能缺少一组QC的一部分，这通常发生在水平设置（horizontal set-up）中。对于垂直设置（vertical set-up），更有可能获得校准品和第1组QC，而不是第二组QC。在这两种情况下，将需要重新读取整个微孔板。如果仪器发生故障，而且读数缓冲液已添加到微孔板中，则可能需要重新分析（re-assay）样品，因为检测信号会随时间显著地减少。
Gyrolab
通常，一个分析运行被定义为一个CD，在每个CD上都放置有校准品和 QCs。如果放置在不同CDs上的QCs的精密度和偏差符合接受标准，则在无人值守的运行中处理的最多五张CDs的系列可以定义为一个单次运行。 这需要测试和评估一个给定的格式是否满足上述接受标准，因为这取决于能否快速捕获待测物的和试剂的稳定性。
需要将接受标准应用于每个CD，这意味着具有失败的QCs和/或失败校准曲线的CDs会被拒绝，而来自同一个多个CD运行中的其它CDs可以通过。如果含多个CD的运行仅有一条标准曲线，并且此曲线不符合接受条件，则此多个CD的运行的所有数据将被拒绝。由于多个CD运行的风险，故应在方法验证时，需要对样品分析时的校准曲线和QCs设置进行评估。在任何情况下，每个CD都必须含有QCs。
如果在运行过程中怀疑针头故障，例如，观察到结构之间（inter-structure）高的CVs，则需要使用供应商提供的仪器日常维护测试方法，测试液体处理装置的性能。故可以识别不符合接受标准的样本，校准品或QCs所使用的针头，并可以在未来的运行中重新分析。液体处理装置有10个针头，分析数据指明了用于转移某一样本的针头。
一些较新的LBA分析平台，包括Gyrolab，提供比ELISA更宽泛的动态范围。尽管如此，仍建议使用相同数量的校准品和 QCs（在每个CD/微孔板的每个QC级别重复两次）进行验证（LLOQ，LQC，MQC，HQC，ULOQ）和样品分析（LQC，MQC，HQC），如同对ELISA方法建议的那样。
Luminex
常见的做法是设置板中（in-plate）校准品，并重复（duplicate）分析校准品和样本。校准品的范围通常比 ELISA的范围更宽，以适应各种待测物浓度，并确定每个待测物的校准曲线和QCs响应。值得指出，对于另一种待测物，校准曲线上的锚定点可能不一样。
如果仪器在运行中失败（即，产生一个部分运行partial run），只要相关校准品和QCs成功完成且可以接受，则仍然可以使用已分析样本的数据。与某些顺序测定平台（sequential platforms）相比，这不太令人担心；而在那些顺序平台上，只有有限的QCs位于相对较大量的样本之间；这样的话，就可能没有足够的QCs来判断许多样本分析的结果是否有效。
BIAcore
该平台与RIA一样，系列式地（in series）分析样品，并使用微孔板加载样本。因此，有两种方法可以运行 BIAcore 样本分析。与 ELISA一样，按96孔，设置校准品和QCs；或者将两个板（或更多）可以作为一个整体来运行：在开始时，分析校准品，并且在整个样本分析中穿插几组QCs。产生部分运行结果的原因，可能是由于仪器故障；也可能是由于未知原因导致QC失败。应根据发生的情况和时间处理仪器故障。在由于未知原因导致QC失败的情况下，当两组已接受的QCs之间的所有样本都需要重新分析时，可以使用bracket approach，如表3所示。
表3. Biacore样本分析设置
总体而言，如果40%或更多个QC失败，则必须重新分析，在可接受的最后一组QC之后的，所有样本。只有在运行开始时的一组QC都通过了的情况下，才能接受第一组样本的分析结果。如果QC的成功和失败是零星的（sporadic），则整个样本分析运行失败，必须进行原因调查。RIA使用类似的方法，系列式地分析一组试管。
实施样本分析的最佳实践
1.在方法开发的过程中，最好消除残留（carry-over），而不是在样本分析中加以计算校正。
2.对于每个平台，应使用短期稳定性数据来确定每次运行的持续时间，以确保样本稳定性。
3.一个分析运行不限于96个数据点（校准品加样本）；例如，对于基于不同硬件支持，如CD和/或系列运行[run in series]，如RIA，BIAcore，Erenna®，和 Gyrolab的平台。
4.在分析运行开始时，首先分析标（校）准曲线；之后，以合理的频率在运行中间隔地分析QCs，以验证该分析平台上的结果。取决于如何定义一个分析运行，可以在每个固体支持（solid support）上设置校准品，也可以设置在一个微孔板/CD上；之后是QCs间隔的一系列样本。无论一个分析运行是如何定义的，应当有规律地多次分析QCs，以确认运行内的精密度。
5.只要在方法验证期间确定的%CV在可接受的范围内，例如，小于或等于目前能够接受的15%（对小分子而言），则可以进行单个样品分析，并采用最严格的接受标准。如果运行超过多个固体支持，则%CV标准指的是重复（duplicate）运行的QCs，和包括多个固体支持的运行内精密度。
6.对于方法转移，在更改分析方法的平台或格式时，大多数平台需要重新验证；即便是部分验证也可能错过对一些关键参数的评估。因此，建议对样本分析方法进行完整的重新验证。
7.Multiplexing：建议尽可能在待测物的混合物中，验证每一个待测物。在样本分析期间，如果一个待测物的分析失败，则应重新分析所有样本，并屏蔽先前合格待测物的分析结果。
总结与前瞻
总之，大多数药物发现阶段的PK/PD免疫分析可以在MSD或Gyrolab平台上进行。Gyrolab还具有运行时间短，样本体积小和自动化，等附加优势，因此对临床前生物分析极具吸引力。无论分析平台如何，本文强烈建议，在最终所需分析方法的同一平台上，筛选试剂和评估方法的性能。在另一方面，超高灵敏度和multiplexing平台是特殊的应用平台，通常不能对试剂进行高通量筛选。因此，可以首先在ELISA，MSD，Gyrolab或BIAcore（SPR技术）平台上对试剂进行筛选，然后在相关特殊平台上优化并最终建立相关方法。Simoa™平台因其超高灵敏度（可以使用微量样本体积）和自动化操作，在相当的程度上可以替代Gyrolab平台，用于临床前PK样本分析。
针对可溶性靶标的新药项目，需要在方法开发的开始，就利用BIAcore平台使用的SPR技术来克服耐受性（tolerance）问题。选择分析平台时，应当牢记最终目标。虽然获得完美的方法参数是最理想的，但就检测方法的局限性和项目需求而言，需要切合实际；因此，需要有愿意在使用的样本体积或分析运行的时间，等参数上，做出妥协，以满足整体需求。与项目团队良好的沟通有助于确定相关工作的优先级别，满足对分析方法的需求并满足相关时间表。当项目的目标预期发生变化时，需要对分析方法的格式保持足够的灵活性，以便在不同的分析平台之间，轻松地转移分析方法。
每个平台在检测试剂，如Sulfo-tag、horseradish peroxidase（HRP或其他酶）方面，差异最大。因此，试剂的生物素化（biotinylation），当与各自对应的链球菌蛋白标记的试剂（streptavidin-tagged reagents）一起使用时，可以实现分析方法在这些平台之间的无缝转移。在需要将捕获试剂生物素化的平台（Gyrolab）上，这些生物素化的试剂可以作为捕获（capture）使用。无论是分析针对可溶性靶标的药物的游离的，还是结合的百分比，或是分析复杂分子的分子完整性，都应当利用免疫测试方法的多功能性（versatility），并相应地考虑合适的分析平台。虽然免疫分析领域正在迅速发展，但LC-MS等正交性生物分析平台也在平行地发展，有时可以作为免疫分析方法的补充。因此，充分了解正交分析平台，并及时向这些平台的团队提示研究方向，将有助于项目的成功。后续文章将介绍相关进展，敬请关注。
特别声明
本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经发表学术期刊、官方网络报道等公开渠道, 不涉及任何保密信息。 参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备。欢迎读者提供有价值的文献及其评估。
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